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    1. MTT染色法:讓細胞生長看的見


      隨著病原微生物學、藥理學和腫瘤學研究的不斷深入和發展,科研部門和臨床醫院對抗腫瘤藥物、微生物病原體及活菌計數、細胞毒性的研究檢測工作日益增多,以往采用的檢測方法如同位素法、臺盼藍法以及 ELISA 法等,雖能測定出相應實驗結果,但檢測過程中多因操作過程繁瑣、檢測周期長、需特定儀器設備、易污染環境等而不盡人意。長期以來,人們一直致力于探索新的更快速、更準確的檢測方法來滿足科研部門和醫院測定工作的需要。MTT 比色法是20世紀 80 年代發展起來的一種檢測細胞數量和增殖狀況的方法,自Mosmann于1983年首創 MTT 比色法用于檢測IL-2的生物學活性以來,MTT法憑借操作簡便、重復性好等優點而受到人們的普遍青睞,現已廣泛應用于各個領域。
       
      1 MTT比色法的原理、方法及特點
      1.1基本原理
      MTT,即溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-dipenyl terazolium bromide〕,cas 298-93-1簡稱四唑鹽,又名噻唑藍;MTT產品為淡黃色粉末,易被水溶解和透過細胞膜而進入細胞內??杀换罴毎麅鹊溺晁崦摎涿高€原,形成不溶于水的藍紫色Fortnazam結晶。該結晶可溶于酸性異丙醇、二甲亞砜、SDS等有機溶劑中,通過多孔掃描分光光度計依顏色深淺可測定出各吸光度值。由于結晶物形成的量與細胞數量及代謝活性成比例,因此吸光度(A)值的大小可反映細胞的數量及活性。
       
      1.2基本操作過程
      1.2.1制備靶細胞,將細胞接種于細胞培養板中,根據靶細胞不同選擇每孔1口一1護個不同的細胞數,預培養(或無)。
      1.2.2加入待測的細胞因子或化學藥物等,同時設相應的對照,置37℃5%CO2環境中培養,培養時間隨測定內容及靶細胞不同而異。
      1.2.3培養終止前4h加入5mg/ml的MTT溶液10~25μl/孔。
      1.2.4終止培養,將所形成的結晶物用有機溶劑完全溶解后,在分光光度計上測定其在波長490nm或570nm處的A值(不同溶劑使用測定波長不同)。用回歸法或概率法推算出活性因子的單位、藥物敏感性或效應細胞殺傷率等。
      1.3 MTT比色法的特點
      1.3.1特異性強。因為琥珀酸脫氫酶只存在于活細胞線粒體內,而不存在于上清液中,所以死細胞和紅細胞均不影響測定結果。
      1.3.2靈敏度高。本法在檢測巨噬細胞毒活性閉、LAK細胞毒活性等時靈敏度均高于同位素法;在檢測抗癌藥物敏感性方面比臺盼藍法準確、靈敏、特異。
      1.3.3快速、準確、重復性好。培養和比色過程中不需洗滌細胞,省時并可避免細胞的丟失,而且比色測定可半自動化,受人的主觀因素影響較小,從而減少了樣品誤差,可同時對大樣本,多種因素進行檢測。
      1.3.4操作簡便、節省材料、不鑄特定儀器,無同位素污染,便于實驗室開展應用。
       
      2 MTT比色法的應用
      2.1 植物抗細胞增殖物質成分篩選研究中的應用
      2.1.1 中草藥提取物體外抗腫瘤活性
      據《本草綱目》等記載,蛇六谷(魔芋)具有性寒、味平、化痰散積及行淤消腫之功,用于治療咳嗽、瘧疾、臃腫風毒等 . 因有解毒抗癌之效而被現代用于治療各種惡性腫瘤 。采用 MTT 比色法觀察蛇六谷各提取物對人肝癌 HepG-2 細胞及大鼠膠質瘤C6細胞增殖抑制作用進行藥物篩選,結果表明:蛇六谷醋酸已酯萃取物、石油醚萃取物對HepG-2細胞及C6細胞呈明顯的量效增殖抑制作用; 林董等也采用MTT比色法,對蕓香、低榆、甘草、柴胡、莪術、蜜蒙花、半邊蓮和旱芹等8種中草藥體外抗肺癌細胞SPC-A1的活性進行檢測。結果表明,濃度為1.5mg/mL的莪術乙醇浸提液(ESCC)和甘草乙醇浸提液(ESCG)對體外培養的肺癌細胞SPC-A1呈較強的濃度依賴性抑制增殖作用。綜上實驗都是通過MTT法來反應細胞增殖狀態從而間接對中草藥體外抗腫瘤作用及機制的研究進行了初步探討,為其臨床治療腫瘤提供了理論依據,且奠定了從天然中草藥中開發抗腫瘤新藥基礎,但其作用機制仍不太明確而有待進一步研究 。
      2.1.2 胡桃楸提取物抑制弓形蟲增殖
      文秋嘉等收集感染弓形蟲小鼠腹水并稀釋至含蟲1×107個/mL,采用MTT比色法測定胡桃楸提取物(JMME)及其含藥血清對蟲體增殖情況的影響,同時設置乙酰螺旋霉素為對照組,結果顯示:胡桃楸提取物可明顯抑制弓形蟲增殖,且具有劑量依賴性,濃度大于30μg/mL 的抑蟲效果優于乙酰螺旋霉素組(P<0.05).弓形蟲可通過胎盤屏障垂直傳播至胎兒,孕婦感染可引起胎兒畸形( 無腦兒、脊柱裂)以及新生兒的先天性弓形蟲病(智力低下、癲癇、致盲及死亡),嚴重影響優生優育 。研究表明: 胡桃楸提取物對弓形蟲具有明顯的增殖抑制和破壞作用,為研究體外抗弓形蟲藥物奠定了理論依據 。該實驗通過應用MTT比色法來觀察蟲體細胞在藥物作用下的增殖狀態,間接評價了藥物抗弓形蟲的作用效果,繼而避免了傳統弓形蟲計數采用的普通染色計數法所帶來的工作量大、誤差大的問題,適合抗蟲藥物的初步篩選。
      2.1.3 烏骨藤對慢性髓性白血病細胞增殖抑制作用
      烏骨藤始載于《滇南本草》,性味苦,微寒,具清熱解毒、消炎鎮痛與止咳平喘等功效,可治療肺炎、慢性支氣管炎、咳喘等疾病?,F代藥理研究表明,烏骨藤含有多種甾體酯苷、生物堿、有機酸、多糖、樹脂及色素等多種化學成分,其獨特化學成分具有明顯的抗腫瘤活性。曾琛等通過 MTT比色法探討烏骨藤提取物是否對人慢性髓性白血病K562細胞存在抑制作用,結果表明:烏骨藤對 K562 增殖有明顯的抑制作用,同時亦可以明顯抑制人肺、胃、肝、大腸來源的癌細胞,且毒副作用輕微。但目前烏骨藤的抗腫瘤作用機制仍未完全闡明,其質量控制指標也有待商榷。
      2.2 癌細胞電離輻射敏感性研究中的應用
      2.2.1 c-erbB-2-siRNA 對結腸癌細胞的放射增敏作用
      趙東利等采用X射線單純放射和放射聯合應用siRNA質粒方法探討兩者對結腸癌細胞 HT-2放射增敏效果。通過MTT比色法測定不同劑量X射線在實驗組(A組)與轉染試劑對照組(B組)、陰性質粒對照組(C組)細胞吸光度(A值),繼而計算比較各組細胞存活分數( SF)。實驗數據顯示,A組在吸光度A值、SF實驗數據均明顯低于B、C兩組;同時,從不同劑量X射線細胞周期分布數據表明,在相同SF下,A組所需X射線劑量最低。綜上說明,對結腸癌細胞HT-29進行放射合并c-erbB-2-siRNA可起到放射增敏作用,能在較低劑量射線作用下降低細胞生存率。本實驗通過凋亡調節改變腫瘤放射敏感性,對臨床在較小的毒副反應下治療腫瘤提供一個新的思路。
      2.2.2 肝癌細胞γH2AX表達與X射線劑量呈正相關
      周萍等采用MTT比色法檢測不同劑量X射線照射肝癌細胞系HepG2后其吸光度A值及相應死亡率,從而探討肝癌細胞γH2AX表達水平與電離輻射敏感性關系。數據顯示,1GyX射線照射時,HepG2死亡率為10.7%,以8GyX射線照射時,HepG2死亡率為47.4%。照射劑量在1~8Gy范圍內增大,HepG2死亡率亦逐漸增高,HepG2死亡率與X射線劑量呈正相關;同時,HepG2死亡率與表達γH2AX的細胞分數高度相關r2=0.951,P<0.05,HepG2灶點數與其死亡率高度相關,r2= 0.984,P<0.05。綜上可知,X射線劑量與HepG2γH2AX表達呈正相關。
      2.2.3 重離子誘導人舌鱗癌細胞凋亡
      重離子因具有高傳能線密度,在腫瘤治療中比傳統的放射治療具有顯著優勢. 有學者給予人舌鱗癌Tb細胞重離子束12C6+輻射,探討重離子對細胞凋亡及 Bax/Bcl-2蛋白表達影響,采用MTT比色法檢測細胞存活率。據MTT比色法繪制的劑量-效應曲線顯示,Tb細胞經12C6+輻射后,存活率顯著下降,呈劑量依賴性增殖抑制,其中12C6+輻射24h、48h后細胞存活率下降最為明顯。綜上說明,對Tb細胞給予24h以上的12C6+輻射,其DNA損傷程度高于自身基因修復能力,繼而凋亡相關基因被激活并誘導細胞凋亡,這意味著Tb細胞受重離子輻射后擺脫了對放射線抗拒期(G0/G1期),而進入對放射線敏感期(G2/M期),這也是臨床分割放療和超分割放療的理論基礎之一,本實驗為該理論提供了現實依據。
       
      結束語
      MTT法在很多領域都有應用,在此就不一一敘述了,但是人們還是比較關心其在癌癥方面的應用,希望通過它能夠找到治療癌癥的藥物,讓癌癥不再讓人覺得恐懼,讓我們人類的壽命能夠更長一點,能做更多的事。
       
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